解锁天然宝藏：唐古特虎耳草（Saxifraga tangutica）药用成分研究（下篇）
书接上篇，通过高压制备系统对样品进行了叶绿素脱除和一维制备，得到的15个馏分在7-10X RPLC上进行分析，结果有多个馏分的谱图均表现出未完全分离的色谱峰。考虑到SFC可能对这些馏分有不同的分离情况，使用7-X10色谱柱和SFC对目标组分A1和Fr1~Fr15进行分析，谱图如下。
图3. 在7-X10分析柱上对目标组分（A1）和馏分Fr1~Fr15（B2-P2）进行SFC分析；
条件：流动相A: CO2，,流动相B：甲醇；梯度：0–20 min, 5 %–65 % B; 检测波长：210 nm；流速：3.0 mL/min；柱温：30–35℃。
在RPLC和SFC中使用7-X10分析柱对目标馏分和15个单独馏分进行分析，色谱图分别见图3 A1-P1和图3 A2-P2。
从图3 A1–P1可以明显看出，7-X10 RPLC的一维制备分离结果中，Fr1、Fr2、Fr3、Fr6、Fr9、Fr12、Fr14和Fr15馏分的谱图均表现出一组未分离色谱峰，表示使用7-X10反相液相色谱对这些馏分的分离存在困难。而在图3 A2-P2中，Fr1、Fr2、Fr3、Fr6、Fr9、Fr12、Fr14和Fr15馏分的谱图显示，使用7-X10 SFC对这些馏分的分离具备更好的潜力。
通过互补机制应用正交分离可以显著提高分离选择性和峰容量，这对于从复杂混合物中分离结构相似的化合物至关重要。为了对这种正交性进行全面的定量评价，基于RPLC和SFC的分析结果，构建了归一化的2D图，该图被划分为15×14个区间，共产生210个网格段，其中数据点占142个区间（如图所示）。根据公式（1）计算，对于7-X10 RPLC和SFC系统，O%的计算值位96.38%。
图4.RPLC和SFC系统中7-X10柱的归一化图；
…………………………………………………………………………………………………（1）
经7-X10 RPLC一维制备分离后，成功地获得了15个不同的级分。必须选择一个能有效证明二维7-X10 RPLC × SFC系统有效性的代表性馏分。值得注意的是，如图3 A1和L1所示，在一维制备过程中，主要化合物有效地分配到级分Fr 11中。它表现出单一主峰的特征。经过彻底的比较分析，最终选择Fr 11作为二维方法应用的最佳代表馏分。因此，将870.8毫克的Fr11重新溶解在3.0 mL的甲醇中，为随后的二维制备做好准备。
选择Fr11进行二维的SFC纯化制备。将之前制备获取的870.8 mg Fr11溶解于3 mL甲醇溶液中。根据之前SFC的分析结果，对色谱条件进行优化，得到以下的结果。
图5. SFC-FRC仪器（A），Fr 11组分样品的优化色谱图（B1），不同上样体积（B2-B5），Fr 11组分样品的第5、10、20和30次制备色谱图（C1-C4），以及Fr 111、Fr 112、Fr 113和Fr 114组分的纯度评估。
条件：等度洗脱：0-45 min，20%甲醇和80%二氧化碳;检测波长：210 nm;流速：3.0 mL/min;柱温：30-35 ℃;收集参数的起始斜率为300 μV/sec，起始阈值为350000μV，结束斜率为− 400 μV/sec，结束阈值为350000μV。
纯度评估条件如下：流动相A：0.1% v/v三氟乙酸的色谱级水溶液；流动相B：甲醇：梯度，0-30 min；15%-95% B；流速，1.0 mL/min；检测波长，210 nm；柱温35 ℃。
由图5可知，得到四种化合物Fr 111、Fr 112、Fr 113和Fr 114，在浓缩干燥后，该纯化过程获得10.10mg的Fr 111组分、6.56mg的Fr 112组分、39.92mg的Fr 113组分和26.60mg的Fr 114组分，总回收率为63.7%。使用HPLC搭配C18-Amide分析柱对所得组分进行分析，如图5 D1-D4所示，四种化合物的纯度均在95%以上。在相同的分析条件下，使用RPLC系统测定四种化合物的保留时间分别为15.130 min、16.088 min、12.217 min和10.453 min，这与在SFC系统（采用7-X10固定相）上的分析结果峰序不同，这可能与C18-Amide固定相上含有的极性酰胺基团有关，使得两种固定相之间产生分离选择性差异。
随后采用了包括ESI-HRMS、¹H NMR和¹³C NMR光谱等分析技术对所得4种化合物进行结构组成的确定。将数据结果与文献记录比较，Fr111, Fr112, Fr113, 和Fr114与muricarpone A，hirsutenone，(5S)−1,7-bis-(3,4-dihydroxyphenyl)− 5-hydroxyheptan-3-one-5-O-β-D-6-O-acetylglucoside，以及(5S)− 1,7-bis-(3, 4-dihydroxyphenyl)− 5-hydroxyheptan-3-one-5-O-β-D-glucoside的相关数据表现出高度一致性。
在以上的研究中，研究者使用汉凰科技NS4000系列产品，对草本植物唐古特虎耳草的提取物进行了纯化制备，显示设计了一种植物提取物的预处理技术，有效去除了叶绿素和高脂溶性成分；进一步使用NS4000设备完成了对样品的反相液相色谱制备，获得了15种不同的组分。
参考文献：Jun Dang a,*, Yingying Tong a,b, Qilan Wang a, Gang Li b, A.M. Abd El-Atyc,d. Innovative orthogonal two-dimensional reversed-phase liquid chromatography × supercritical fluid chromatography with a phenyl/ tetrazole stationary phase for the preparative isolation of diarylheptanoids. Journal of Chromatography A. 1726(2024)464950, ISSN 0021-9673, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2024.464950
谨此致谢：以上期刊论文的研究对本公司制备液相色谱系统的使用与支持！
汉凰科技NS4000系列高压制备色谱：赋能天然产物分离纯化
- 应对复杂样品：实现精准的“大海捞针”
依托丰富的天然产物项目经验，利用我们的制备系统（SFC超临界流体色谱、高压制备、连续离交等），搭配柱效30000p/m以上的色谱柱，即使是手性化合物、结构类似物（如皂苷同系物、生物碱异构体）也能实现高效分离，从复杂基质中捕获目标成分，使目标组分纯度达99%以上。
- 攻克微量活性成分：最大化回收率
有超过100种类型色谱柱，批量筛选分离介质，专为捕获微量物质而优化工艺。团队通过优化吸附剂、流动相和梯度程序，发现并获得1μg级的微量成分，提高目标物的回收率达80%以上，确保每一分珍稀提取物物尽其用，提升研发产出的科学和经济价值。
- 打破工艺放大壁垒，降本增效：全自动配置，辅助mg到kg级的平滑放大
系统可配备全自动进样、馏分收集功能，实现实验室无人值守，稳定重现1000次。从小试阶段就着眼于放大生产，确保您的纯化方法能够从实验室到中试制备，再到工业化生产级完美线性放大，方法转移高效无忧。
