解锁天然宝藏：唐古特虎耳草（Saxifraga tangutica）药用成分研究（上篇）
利用科研新手段加速活性成分研究—汉邦/汉凰科技高压制备液相系统应用案例
如今在天然产物的研究中，分离纯化手段是多种多样的。其中常用的是一维液相色谱法（1D-LC）。而传统的一维液相色谱法经常会受到色谱分离效率和峰容量的显著限制。二维色谱则可以利用不同色谱系统的分离机制的差异性，提高分辨率和峰容量。然而1D-LC/2D-LC的可能会因为固定相被污染，导致柱效受到严重影响，这通常是由于植物提取物样品被直接注射到色谱系统中，样品中的叶绿素等物质吸附在固定相中难以被洗脱。
超临界流体色谱（SFC）由于其利用超临界状态的CO2作为流动相，而具有多种优点，例如低粘度、高流速下的高效率和环境可持续性。超临界流体技术已应用于天然产物及其异构体的分离，与传统的反相液相色谱（RPLC）相比，由于其独特的选择性，在异构体分离方面表现出独特的优势。这种独特的选择性可能使RPLC×SFC二维体系中存在相当程度的正交性，这可能成为RPLC×SFC二维色谱分离的关键。
基于已有的反相液相色谱和超临界流体色谱（SFC）在天然产物纯化中的应用，研究者旨在开发一种应用于天然产物的分离纯化新技术，即使用离线的反相液相色谱（RPLC）×超临界流体色谱法（SFC），且仅使用7-X10固定相进行天然产物的制备分离。
该研究以一种产于青藏高原地区的多年生草本植物，唐古特虎耳草（Saxifraga tangutica）的地上部分的提取物为研究对象。室温下使用甲醇对样品浸提，提取液通过0.45μm尼龙膜过滤。提取液中含有大量的植物叶绿素，这些叶绿素若是进入硅胶基质的固定相则会吸附其上，导致色谱柱的柱效降低，因此在正式制备前有必要先去除提取液中的叶绿素。
研究者使用自装填的CHP20P中压柱来进行样品提取液的预处理。使用一台色谱泵将样品提取液以30mL/min的流量输送通过中压柱，根据紫外检测器谱图收集流出液。
图1. 汉凰科技制备液相系统+CHP20P 中压柱(A), 唐古特虎耳草甲醇提取液(B), 前处理溶液(C), 紫外色谱图(D), 运载样品溶液部分(E) 和甲醇洗脱部分(F)。
色谱条件: 流动相 A: 唐古特虎耳草甲醇提取液, and B: 甲醇; 梯度: 0–167 min, 100 % A, 167–195 min，100 % B; 检测波长: 210 nm; 流速: 30.0 mL/min.
对比样品的甲醇提取液和经过中压柱后的前处理溶液，其中干物质的含量从4.38 mg/mL降至1.38 mg/mL。这种固体含量的减少是由于叶绿素和高脂溶性成分，被留在了CHP20P中压柱中。除去的干物质重量计算为14.5g，相当于去除率为66.2%。这为后续纯化制备中使用的硅胶基质固定相提供了极大的保护。
样品的正式纯化制备将分为一维、二维两个步骤。
由于目标组分在反相溶剂系统中的溶解度有限，故在一维反相色谱纯化中选择干法上样。将前处理溶液减压浓缩，得到20mL浓缩液；将浓缩液于30g无定形硅胶混合，并在40℃下干燥湿混合物，最终得到干燥的样品，称重为37.4g。
通过调研，研究者选择了7-X10固定相自装填色谱柱（49×460mm，7μm），搭配干法上样，实现一维反相液相色谱制备分离。
图2. 汉凰科技制备液相系统+7-X10反相分离柱(A), 干法上样柱 (A1)，X10分离柱 (A2)，X10固定相结构(A3) 和一维7-X10反相液相制备色谱图(B).
条件: 流动相A:色谱纯水含0.1% v/v三氟乙酸（TFA），流动相B: 甲醇；梯度: 0–120 min,
0 %–100 % B; 检测波长210 nm; 流速: 80.0 mL/min。
根据图2.B，研究者共收集到15个不同馏分，将其全部回收旋干称重后，再重新溶解于甲醇，用于后续的分析和制备。
图3. 在7-X10分析柱上对目标组分（A1）和馏分Fr1~Fr15（B1-P1）进行反相液相色谱分析；
条件：流动相A:纯水中含有0.1 % v/v三氟乙酸（TFA），流动相B：甲醇；梯度: 0–60 min, 0 %–100 % B；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱温: 30℃。
在RPLC使用7-X10分析柱对目标馏分和15个单独馏分进行分析，色谱图分别见图3 A1-P1。
从图3 A1–P1可以明显看出，7-X10 RPLC的一维制备分离结果中，Fr1、Fr2、Fr3、Fr6、Fr9、Fr12、Fr14和Fr15馏分的谱图均表现出一组未完全分离的色谱峰，表示使用7-X10反相液相色谱对这些馏分的分离存在困难。
通过互补机制应用正交分离可以显著提高分离选择性和峰容量，这对于从复杂混合物中分离结构相似的化合物至关重要。
那么SFC对上述馏分的分离效果又会如何呢？我们下期分晓。
参考文献：Jun Dang a,*, Yingying Tong a,b, Qilan Wang a, Gang Li b, A.M. Abd El-Atyc,d. Innovative orthogonal two-dimensional reversed-phase liquid chromatography × supercritical fluid chromatography with a phenyl/ tetrazole stationary phase for the preparative isolation of diarylheptanoids. Journal of Chromatography A. 1726(2024)464950, ISSN 0021-9673, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2024.464950谨此致谢：以上期刊论文的研究对本公司制备液相色谱系统的使用与支持！
